蛋白质是生物学功能最主要的承担者，在执行各种生理活动中起着至关重要的作用。同时，蛋白质之间也存在着复杂的相互作用，这些构成了复杂生理过程的生物化学基础。蛋白质之间相互作用的研究，方法众多，各有千秋，一般来说可以分为以下几大类：生物物理学方法，主要通过检测反应体系中光学、温度等的变化来推知分子间作用，比如SPR，ITC，MST等；分子生物学方法，主要是通过报告基因和噬菌体展示体系，如酵母双杂交方法等；遗传学方法，主要是通过蛋白质产物的互补或者抑制效应来推断相互作用，如合成致死筛选，基因外抑制子等。本次我们主要讨论应用生物物理学方法进行蛋白质相互作用的研究。

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）

SPR是指在光波的作用下，在金属和电介质的交界面上形成的改变光波传输的谐振波。在介质（一般为玻璃）表面涂上一层金属薄膜（一般为金属），入射光在界面处发生全内反射时，产生的消逝波渗透到金属薄膜内，可以激发金属表面等离子体使之产生等离子波。当入射光的入射角和波长在某一适当值时，表面等离子波与消逝波的频率和波数相等，此时两者将发生共振，入射光能量被吸收，反射光强大幅度减弱，可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此为共振峰，对应的入射角为SPR角。SPR角随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合的分子的质量成正比。当目标分子结合到传感器表面时，能够引起SPR角度的变化，我们可以通过检测谐振角、谐振波长或谐振强度的变化来反应生物分子之间的相互作用。

图1：SPR基本原理。

目前比较广泛使用的是GE开发的BIACORE系列产品。其主要操作分为3个步骤：ligand与芯片的偶联；测试物进样分析；芯片再生。目前，Biacore有9中芯片满足各种实验的需求。比如SA芯片被用于捕获生物素标记的配体；NTA芯片用于捕获His-tag修饰的配体；L1则被直接用于直接捕获脂质体分子并保持其活动。测试物在进样之前，要保持足够的溶解性，一般需要通过0.2um的滤膜进行过滤。再生是难点之一，也是保证高质量数据的必须环节。理想的再生，结合曲线保持稳定，多次进样和第一次进样相比，响应值的变化保持在10%以内。值得一提的是，以Biacore为代表的SPR技术是FDA、EMA重点推荐的药物结合活性检测技术，并且被收录入最新版的美国、日本药典（USP39、JP17）中，在大部分已上市的抗体药的研发与生产中，都使用了Biacore。

微量热泳动（Microscale Thermophoresis，MST）

蛋白质因为其表面的水化层和双电层的存在，从而能够形成稳定的胶体溶液。蛋白质在这种溶液中会形成特定的微观温度梯度。如果蛋白质的构象、分子量、电荷发生变化，则会导致其在微观温度梯度场中的分布改变，通过监测这种改变就能够追踪蛋白质之间或者与其它分子之间的相互作用，这就是MST的原理。

德国公司NanoTemper利用MST的原理研发了相应的产品-微量热泳动仪，用来测量溶液中蛋白质之间的相互作用。该仪器通过毛细吸管中心的红外激发和外围的冷却，在毛细吸管中产生精确地微观区域的温度梯度差异。将所需要测量的溶液填充到毛细吸管之中，然后通过监测溶液中分子的荧光信号的分布进而定位其在温度梯度场中的分布。该荧光信号可以来自分子的自发荧光（如蛋白中的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸），也可以是标记到蛋白上的荧光染料（如SYPRO Ruby）或者融合表达的荧光蛋白（如融合的GFP、RFP等）。如果溶液中有复合体形成，则会导致原来的蛋白质分子热泳动效应发生改变，从而可以准确而灵敏测量分子间的相互作用以及分子结构的变化。

图2：MST检测示意图。

这种技术的优点之一是能够在各种溶液中进行分子间相互作用的测量，不需要进行测试前的纯化，大大简化了实验流程。除了蛋白质之间的相互作用，还能够测量离子、小分子、多肽、蛋白、核酸、脂类、糖之间的相互作用。

等温滴定量热（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）

ITC是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。生物分子结合过程中，会从环境中吸收或者释放热量，通过超级灵敏（几百万分之一摄氏度）的微量量热仪来测定热量的释放或者吸收就能够判断分子的结合。

微量量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品（称之为配体）。开始时候，参比池和样品池被设定到所需的实验温度。将待测物（比如潜在的受体）装入一个能够精确控制滴定剂量的注射器中。将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。按照一定的剂量将配体逐步注入到蛋白质溶液中。如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。测得的热量与结合量成正比。然后，热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。随着反应的进行，配体与受体之间的摩尔比随着一系列配体试样的注入而逐渐增加。蛋白质越来越饱和，配体结合的次数越来越少，并且热量变化开始减小，直到样品池中的配体数量相对于蛋白质而言最终表现出过量为止，终止实验，进行计算。

图3：ITC测量的基本原理。

ITC可以无需通过荧光标记就可以测定受体-配体在自然状态下的亲和力。ITC是唯一能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。该方法能够获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（ΔH）、摩尔结合熵（ΔS）、摩尔恒压热容（ΔCp），和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。

生物膜层干涉（Biolayer Interferometry，BLI）

光通过传感器的生物膜层后会发生反射，反射光的频率受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光会与入射光会产生相长干涉现象（下图中蓝色波所示），而另一些受到了相消干涉（下图中红色波所示）。这些干涉光波被光谱仪所检测到，形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相对位移强度(nm)显示。当结合在传感器生物膜上的分子与待测溶液中的分子结合后，传感器上的生物膜层厚度就会增加，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，这个相对位移随着待测分子结合量的增加而增加，最后达到一个平衡状态。通过计算干涉光谱的位移，就能够推知生物分子之间的相互作用以及结合情况。

图4：BLI原理示意图。

该技术可检测蛋白质、核酸、多糖、脂类、抗体、病毒、细菌及细胞等各类样品，已经广泛应用于蛋白结构靶点分析、药物研发与筛选、免疫学、基因调控、信号通路、遗传学、微生物组学、病毒学、纳米颗粒、脂质体、中药提取物及天然产物分析等生命科学研究领域。

上述4种方法，不仅能够应用与蛋白质相互作用的研究，有些还能够应用于蛋白质与核酸、病毒等之间相互作用的研究。而且，随着技术本身的革新，智能化、便捷化的仪器随之问世并不断升级。但是，每一种技术都有其优势及局限性，比如Biacore技术目前应用最为广泛，但是其进样分析前样本需要前处理，增加了操作步骤。再比如，BLI不使用芯片耗材，成本较低，但是其不太适合于蛋白质与小分子之间的研究。研究者需要根据自自身实际状况，挑选适合自己的仪器和实验方法。另外，数据分析系统及实验者的经验，也会对实验结果造成很大的影响。

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