Credit：ANGELA GAO

撰文 | 秦芳菲

责编 | 汤佩兰

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2020年7月14日，由哈佛大学布罗德研究所化学生物学家刘如谦（David R.Liu）与华盛顿大学微生物学家 Joseph Mougous 合作有关基因编辑论文在《自然》发表，开发出了 “第一例线粒体DNA精确编辑的分子工具” [1]。

“该工具在人体细胞的实验室实验中发挥了作用，可能开启一扇新的研究之门，以及未来数十种难以治疗的由线粒体 DNA (mtDNA)突变引起的疾病的新疗法。”《科学》杂志对该技术评价道 [2]。

过去几年，围绕 CRISPR 研究，David Liu 在碱基编辑范围，对特异性，精确性和体内递送方向均作出了显著进展，并在基因编辑治疗疾病方向也有深入研究 [3][4]。

但目前 CRISPR 技术都是进入细胞核中，改造染色体 DNA，可能用于治疗细胞核遗传物质突变导致的疾病。对于人类细胞来说，不只细胞核中有 DNA，细胞质的线粒体也存在 DNA，这些基因突变同样会造成遗传病。

图1 线粒体 图源lifespan[5]

线粒体内的DNA编码13种蛋白质，虽然种类不多，但每一种都参与到细胞的能量供应链中。线粒体DNA突变可能导致数十种代谢疾病，包括心肌病、Leber 遗传性视神经病变等，而且这些疾病至今没有治愈方法。开发可以精确纠正线粒体DNA的基因编辑工具，将为治疗这类疾病打开大门。

CRISPR 系统需要有一段向导 RNA（gRNA）定位到基因组特定位置，而RNA是不能够进入线粒体的（图2）。因此，目前改造线粒体DNA的方法主要利用无RNA系统的核酸酶，包括转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和锌指核酸酶（ZFN）（注：CRISPR、TALEN和ZFN为基因组编辑三大技术）融合到线粒体靶向信号序列上，引发环状线粒体DNA 双链断裂成线性化的 DNA，再对 DNA 进行编辑。然而，线性化的线粒体 DNA 往往还没有来得及修复就被迅速降解，从而容易引发不易被切断的线粒体基因组的不均衡分布，细胞分裂过程造成异质性。鉴于此方法不能用于改变线粒体 DNA 特定碱基，因易导致DNA降解也不能用于同质线粒体 DNA 突变，而应用受限。

图2 CRISPR-Cas9系统需要gRNA （图源Thermo）

在研究细菌之间如何用毒素相互攻击时，Mougous 与同事有一个偶然发现。一般来说，这些毒素属于细菌脱氨酶，它们往往通过识别单链DNA（ssDNA）、RNA、游离核苷、核苷酸、核酸碱基或者其他的核苷酸衍生物，而不识别双链 DNA（dsDNA）。因此，当科学家们研究新型毒素的作用时，往往用 dsDNA 作为对照。意外的是，他们发现了这种新型的细菌脱氨酶，虽然对 ssDNA 没有效果，但是可以直接修改对照组 dsDNA 上的碱基，把其中的胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U），从而杀死细菌（图3）。于是，他们将这种细菌毒素命名为 DddA (double-stranded DNA deaminase toxin A，双链DNA脱氨酶毒素A)。

图3 以往的细菌脱氨酶作用于单链DNA，不切割双链DNA，而新发现的DddA可以切割双链DNA，而对单链DNA无效

不过，这种细菌毒素对于人体细胞是有毒的，如果不加以控制，它将肆意破坏 DNA，将遇到的所有胞嘧啶（C）都进行突变。为了使其可以进行精准的线粒体 DNA 编辑而不对细胞造成损伤，科学家们设想了巧妙的办法：他们找到毒性结构域 DddAtox，根据结晶得到的 DddAtox 的活性口袋，将它一分为二，变成没有活性的两个片段，只有当它们到达特定位置后彼此融合，才恢复脱氨酶功能（图4）。David Liu 将其称之为 “驯服野兽” 的过程。

图4 分割为N端和C端部分的DddAtox，只有当融合后，才能行使功能

接下来，在模式细胞人类人胚胎肾细胞 HEK293T 中，研究人员证实了DdCBE系统的编辑能力。他们测试了线粒体基因组中的5个基因，处理3~6天后，碱基编辑效率在4.6%~49%（图5），脱靶效应基本也在0.05%以下。

图 5 DdCBE系统的编辑能力

Mootha 表示，“这是我的职业生涯中首次实现线粒体 DNA 的精准编辑，这是一次质的飞跃。如果我们可以实现靶向突变，我们就可以开发疾病相关突变的研究，并发展有效的治疗药物。” [6] 不过，David Liu 对《自然》杂志表示，这距离应用到临床还有很长的路要走，其他类型的细胞还有待研究 [7]。

据《自然》杂志报道，这种技术弥补了现有治疗线粒体疾病的方法。目前，英国已经批准了 “线粒体置换” 的方法，将卵细胞或者胚胎细胞中的线粒体置换为健康供体的卵细胞或者胚胎细胞的线粒体。剑桥大学线粒体遗传学家 Michal Minczuk 表示，这种新型的编辑技术将使研究者们能够纠正错误的突变，即使线粒体中没有足够的数目的DNA拷贝数。尽管真正的医用还很遥远，但是短期看来，研究者们就已经可以通过利用该技术生成动物模型，来研究线粒体突变的影响 [7]。

参考资料：

[1]Mok, B. Y.; de Moraes, M. H.; Zeng, J.; Bosch, D. E.; Kotrys, A. V.; Raguram, A.; Hsu, F.; Radey, M. C.; Peterson, S. B.; Mootha, V. K.; Mougous, J. D.; Liu, D. R., A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 2020. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

[2]https://www.sciencemag.org/news/2020/07/new-method-edit-cell-s-powerhouse-dna-could-help-study-variety-genetic-diseases

[3]Yeh, W.-H.; Chiang, H.; Rees, H. A.; Edge, A. S. B.; Liu, D. R., In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nature Communications 2018, 9 (1), 2184.

[4]Shen, M. W.; Arbab, M.; Hsu, J. Y.; Worstell, D.; Culbertson, S. J.; Krabbe, O.; Cassa, C. A.; Liu, D. R.; Gifford, D. K.; Sherwood, R. I., Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature 2018, 563 (7733), 646-651.

[5]The First Precision Gene Editing Tool for Mitochondrial DNA. https://www.lifespan.io/news/the-first-precision-gene-editing-tool-for-mitochondrial-dna/

[6]New molecular tool precisely edits mitochondrial DNA. https://www.sciencedaily.com/releases/2020/07/200708121436.htm

[7]Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time. https://www.nature.com/articles/d41586-020-02054-5